Начало «эпохи клонирования»

«История» клонирования берет начало в далеких 1940-х гг., когда выдающийся российский эмбриолог Георгий Викторович Лопашов разработал метод трансплантации (пересадки) ядер в яйцеклетку лягушки. В июне 1948 г. он отправил в «Журнал общей биологии» статью, написанную по материалам своих экспериментов. На его беду, в августе 1948 г. состоялась печально известная сессия ВАСХНИЛ, <…> и набор статьи Лопашова, принятый к печати, был рассыпан.

Работу Лопашова забыли, а в 1950-е гг. американские эмбриологи Бриггс и Кинг выполнили сходные опыты, и приоритет достался им, как уже часто случалось в истории российской науки.

Справедливости ради следует отметить, что Бриггс и Кинг пошли дальше. Они усовершенствовали методику переноса ядер, удаления собственного ядра яйцеклетки и добились достаточно далеко продвинутого развития животных с трансплантированным ядром, получая целые клоны эмбрионов на разных стадиях развития. Однако все эмбрионы в конце концов останавливались в своем развитии, и взрослое животное получить не удавалось. Тем не менее эти опыты дали пищу для обсуждения генетических механизмов развития животных и позволили исследовать функциональное состояние ядра клеток на разных стадиях развития, что раньше невозможно было делать в таких масштабах. В США попробовали поставить такие же эксперименты на дрозофиле, но они завершились неудачей – клонированная муха не получилась.

В дальнейшем Джон Гердон из Великобритании усовершенствовал методику и стал удалять из яйцеклетки лягушек собственное ядро и трансплантировать в нее разные ядра, выделенные из специализированных клеток. В конце концов он дошел до того, что начал пересаживать ядра из клеток взрослого организма, в частности, из эпителия кишечника. Яйцеклетки с чужим ядром развивались и часто до достаточно поздних стадий: 1–2% особей проходили стадию метаморфоза и превращались во взрослых лягушек. Впрочем, получались такие лягушки не без дефектов да и выглядели более хилыми по сравнению со своими «родителем», так что даже в этом случае едва ли можно говорить об абсолютно точном копировании.

Схема получения клонированных лягушек по Гердону

А нельзя ли и человека проклонировать?

Тем не менее вокруг достижений британского ученого поднялся большой шум. И вот тут-то заговорили о клонировании млекопитающих и человека: если можно клонировать лягушку, почему бы ни попробовать то же самое на других объектах.

Появились научно-фантастические рассказы о человеческих клонах, творящих то добро, то зло, используемых то тупыми солдафонами, то недальновидными политиками. Снимали и кинофильмы на эту тему.

Конечно же, всякие разговоры о клонировании человека в настоящее время лишены оснований. Уже в экспериментах такого рода на приматах, наших ближайших родственниках, возникли непредвиденные сложности. <…> Первые клонированные приматы были получены методом переноса ядра ранней эмбриональной клетки несколько лет назад. Но ядра ранних эмбриональных клеток, конечно же, существенно отличаются от ядер соматических клеток. Первые еще не специализированы и не нуждаются в репрограммировании для обеспечения нормального развития зародышей, вторые – уже специализированы и не способны обеспечить нормальный онтогенез. Потому-то получение клонов млекопитающих на основе использования ядер ранних эмбриональных клеток не должно вызывать особого удивления. А речь-то идет о воспроизведении в виде клонов чем-то показавших себя выдающихся животных (или людей), например, коров-рекордисток по молоку или овец по настригу шерсти. Для этой цели необходимы ядра «взрослых» клеток от животных, которые уже охарактеризованы и известны по своим полезным качествам. Ядра от эмбриональных клеток тут не подходят: ведь неизвестно, что из этих эмбрионов получится, когда они вырастут и станут взрослыми!

И вот, когда стали использовать для пересадки ядра соматических клеток приматов, обнаружилось множество неприятных неувязок, в частности, нарушения в расхождении хромосом при делении яйцеклетки. Было предложено несколько модификаций переноса, применение которых привело к успехам в созданию человеческих бластоцист, например, более мягкое извлечение (выталкивание) комплекса хромосомного веретена, использование определенной стадии развития яйцеклетки для удаления ядра, а также некоторые новшества при культивировании яйцеклетки.

Очень удобно оказалось использовать метод электрослияния яйцеклетки с соматической клеткой при одновременной ее активации к развитию. В этом случае при переносе ядер фибробластов (клеток соединительной ткани) получали жизнеспособные бластоцисты в 43% случаев удачного слияния клеток. При этом строение ядер в клетках бластоцисты было нормальным, не обнаруживалось и отклонений в поведении хромосом. Однако если для слияния использовали ядра клеток, прилежащих к самой яйцеклетке, ни одной бластоцисты получить не удалось, несмотря на применение разных методов активации яйца. Эмбриональные стволовые клетки, выделенные из таких бластоцист, прекращали рост в культуре через неделю. Это, кстати, создает дополнительные проблемы для так называемого терапевтического клонирования.

Схема генетического клонирования овцы (по Асланяну)

Существенно и то, что из 135 переносов эмбрионов приматов в матку суррогатной матери ни один не завершился развитием беременности. Несмотря на кажущуюся нормальную морфологию ранних эмбрионов, во многих ядрах составляющих их клеток развивались хромосомные аномалии, наблюдались нарушения в структуре ДНК. Нарушался процесс клеточного деления уже на уровне четырехклеточных, восьмиклеточных и т. д. стадиях, что приводило к быстрой остановке развития эмбрионов.

Таким образом, приматы являются одним из самых трудных объектов для клонирования. Оказывается, для нормального развития раннего эмбриона приматов необходимо присутствие сперматозоида! При клонировании других животных это не требуется. В результате до сих пор так и не удалось получить жизнеспособный эмбрион приматов, способный к развитию в организме приемной матери, методом клонирования. Все попытки переноса бластоцист в матку не заканчивались беременностью.

Что уж тут говорить о человеке! Совершенно ясно, что в данном случае трудности, с которыми столкнутся ученые, будут, по крайней мере, не меньшими, а скорее всего, гораздо большими!

Шотландское «чудо»

В феврале 1997 г. появилось сообщение, что в лаборатории Яна Вильмута в Рослинском институте (Эдинбург, Шотландия) разработан эффективный метод клонирования млекопитающих и на основе его использования получена овечка Долли.

Прежде всего, естественно, необходимо было выделить ооциты (яйцеклетки). Их извлекли из овец породы Шотландская черномордая, поместили в искусственную питательную среду с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37 ђ8С и провели операцию энуклеации (удаления собственного ядра). После этого для обеспечения яйцеклетки генетической информацией от организма, который надлежало клонировать, использовали диплоидные клетки молочной железы взрослой беременной овцы породы Финский дорсет. Эти клетки выводили из стадии роста клеточного цикла, разбавляя сыворотку, и через 5 дней сливали с энуклеированным ооцитом. Последний затем активировали к развитию посредством электрического «удара». Кстати, такой метод намного раньше использовали в лаборатории Чайлахяна в Пущино. Развивающийся зародыш культивировали в течение 6 дней в искусственной химической среде или в яйцеводе овцы, перетянутом лигатурой ближе к рогу матки. Затем эмбрионы (от 1 до 3) трансплантировали в матку приемной матери, где они могли развиваться до рождения. Из 236 опытов успех сопутствовал лишь одному, в результате которого и родилась овечка Долли, содержащая генетический материал взрослой овцы (которая умерла три года назад).

После этого Вильмут заявил, что технически возможно осуществить и клонирование человека, но в этом случае возникают моральные, этические и юридические проблемы, связанные с манипуляциями над эмбрионами человека. Недавно пришло сообщение из Японии, в котором объявлено, что там пытаются клонировать коров по методу Вильмута и что уже родились два «клонированных» теленка. Отмечается, однако, что телята родились ослабленными и неизвестно, выживут ли они.

...Перед биологией, казалось бы, открылись новые заманчивые перспективы, ученые стали задумываться над глобальными проектами, всерьез обсуждать этическую сторону проблемы...

Почему-то никто не обратил внимания на то, что даже если у Вильмута было все в порядке, процент выхода рожденных животных был ничтожно мал – всего одна овечка из 236 попыток. А что с остальными? Уроды, погибли? И где же, собственно, клон, предполагающий множество копий?

Схема клонирования мышей по Янагимачи

Потому-то особый интерес вызывают опыты группы ученых из университета в Гонолулу во главе с Риузо Янагимачи. Авторам удалось усовершенствовать метод Вильмута, они отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели такую микропипетку, с помощью которой можно было «безболезненно» извлекать ядро из соматической клетки и трансплантировать его в лишенную ядра яйцеклетку. Авторы использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит, клеток Сертоли из семенников и клеток, выделенных из мозга (авторы утверждают, что нейронов, однако из текста статьи не очень понятно, нейронов или глии). Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью микропипетки. Яйцо активировали к развитию помещением в специальный раствор. Эмбрионы культивировали до стадии 2–8 клеток и затем трансплантировали в матку приемной матери, где многие из них имплантировались и некоторые (15–16%) продолжали развитие. Процент «выхода» рожденных мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18,5–19-й дни беременности) был, однако, низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер рожденных мышат к клеткам донора соматических клеток. Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях, была доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих. Следовательно, получение клона принципиально возможно, однако это еще не означает получения точной копии клонированного животного.

Например, однояйцевые (монозиготные) близнецы человека развиваются в матке одной матери, т.е. в абсолютно равных условиях, так что пределы колебаний различных признаков в рамках нормы реакции сведены к минимуму, тем не менее и у них обнаруживают различия, иногда существенные. В случае использования приемных матерей при клонировании млекопитающих столь идеальные условия создать невозможно, и значит абсолютная точность копирования исходной особи едва ли может быть обеспечена.

Корочкин Л.И. Клонирование. – Фрязино: «Век 2», 2006.

Источник: часть1, часть 2.